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Proceso histológico

En 1883, J. Jacobson propuso el uso de ácido crómico para tratar las piezas que iban a ser observadas, para endurecerlas y observarlas por el microscopio, lo que favoreció los estudios en histología. Esta técnica fue considerada la primera fijación histológica.
F. Blum en 1893, se dio cuenta de la capacidad del formaldehido para preservar los tejidos. La parafina se usó por primera vez por Klebs, como soporte de la pieza durante el cote. Las coloraciones se fueron descubriendo lentamente por muchos científicos, entre ellos Fellice Fontanal, Ramón y Cajal y Weissman.
El Proceso Histológico es una serie de métodos y técnicas utilizados para poder estudiar las características morfológicas y moleculares de los tejidos:

Tecnicas histológicas
1. Obtención del tejido: biopsia animal
2. Fijación: para evitar procesos degradativos de las estructuras tisulares (acción de enzimas intracelulares-autodigestión- y putrefacción por acción bacteriana).
Fijar un tejido: es preservar sus características morfológicas y moleculares lo más parecidas posibles a las que poseía en su estado vivo.
Tenemos que tener en cuenta antes de su uso:
Velocidad de penetración
Velocidad de fijación
Endurecimiento
Ósmosis y pH. Lo más parecido posible a la del tejido
Efecto mordiente
Artefactos introducidos durante la fijación
Métodos físicos: congelación
Métodos químicos:
a) Inmersión: las piezas del tejido se sumergen en una solución fijadora
b) Perfusión: la solución fijadora se introduce a través del sistema circulatorio por donde accede a todas las células del tejido por la red de capilares
Simples: etanol, metanol, acetona, acido acético, cloruro o sulfato de cinc, ácido picrico, formaldehido, glutaraldehido, tetróxido de osmio
Mezclas: líquido de Bauin, solución de Clarke, mezclas con formaldehido, gluraldehido-tetróxido de osmio.
3. Inclusión: hacer secciones de los tejidos que se han de estudiar, pueden ir desde nanómetros hasta centenares de micras.
Microtomo para parafina: 5-20 micrómetros
Microtomo manual: 100 micrómetros
Vibratomo: 30-100 micrómetros
Microtomo de congelación: 30-100 micrómetros
Criostato: 10- 40 micrómetros
Ultramicrotomo: 0,5 – 1 micrómetros
Ultracriotomo: nanómetros

4. Tinción: los tejidos animales en general son incoloros excepto algunos como la melanina de la epidermis o la hemoglobina de la sangre.

Cuando se inventaron los primeros microscopios hubo que descubrir como teñir los tejidos para estudiar las características morfológicas. Se observó que algunos pigmentos como el carmín o la eosina, disueltos en agua, se unían a los tejidos.
El desarrollo de la industria textil en el siglo XIX y la necesidad de colorear las telas provocó un gran desarrollo de tintes y pigmentos.
Con la biología molecular se han desarrollado técnicas para observa elementos celulares: usando anticuerpos, inmunocitoquímicas, sondas de ADN y ARN, hibridaciones “in situ”, diseño de animales transgénicos (células que expresan un gen) y GFP (fluorescencia de la proteína verde).

a) Tinciones generales: sustancias coloreadas que se unen a componentes celulares por afinidad electro-química.
b) Histoquímica: implica modificación química de moléculas tisulares para ponerlas de manifiesto con colorantes.
c) Lectinas: dominios de proteínas que reconocen glúcidos que forman parte de polisacáridos (para determinar glúcidos en glicoproteínas de las células o de la matriz extracelular).
d) Inmunocitoquímica: especificidad de la unión de anticuerpos a los antígenos contra los que se produjeron.
e) Hibridación: técnicas basadas en la unión complementaria de las bases de los ácidos nucleicos (adenina-timina, o con el uracilo; guanina-citosina).

Una tinción o coloración es una técnica auxiliar utilizada en microscopía para mejorar el contraste en la imagen vista al microscopio.
Los diferentes colorantes pueden ser utilizados para aumentar la definición y examinar:
Grandes cortes de tejido ( resaltando por ejemplo fibras musculares o tejido conectivo)
Poblaciones celulares ( por ejemplo células sanguíneas)
Organelas en las células individuales.

Una tinción in vivo “tinción vital” es el proceso de teñir tejidos vivos. Se puede estudiar su ubicación y morfología mientras están desempeñando su función. Donde aparece un determinado producto químico o donde se lleva a cabo una determinada reacción química dentro de las células o tejidos.
Una tinción in vitro “supravital” involucra el coloreo de células o estructuras que han sido removidas de su contexto biológico. Una “contratinción” es una tinción que consigue que las células o estructuras sean más visibles cuando no se consigue que sean totalmente visibles con la tinción principal.
Métodos de tinción in vitro:
a) Preparación:
Fijación: es una modificación de las propiedades fisicoquímicas e las proteínas que forman una célula o tejido y que tiene por afinidad preservar las formas de las células o tejidos tanto como sea posible. Entre los fijadores químicos más comunes se encuentran: el formaldehido, etanol, metanol, y el ácido pícrico. Pequeños bloques de tejido pueden ser embebidos en parafina o algún polímero, proceso conocido como inclusión, para incrementar su resistencia y estabilidad, y para hacer más fácil cortarlos en rodajas extremadamente delgadas. Permeabilización: este paso implica el tratamiento de las células con un surfactante, tiene como finalidad disolver la membrana celular para permitir que las grandes moléculas de colorante puedan acceder a las estructuras del interior de las células. Montaje: frecuentemente implica adherir los cortes histológicos a un portaobjetos de vidrio para su observación al microscopio o análisis. Para piezas de tejidos de mayor tamaño, se utiliza un micrótomo que corta la muestra en rodajas sumamente delgadas.
b) Tinción adecuada:
Muchos tintes requieren el uso de mordiente: un compuesto químico que reacciona con el colorante para formar un precipitado coloreado insoluble. Los colorantes han de estar certificados, es decir evaluados por un organismo independiente, la Biological Stain Commission, los estándares son publicados detalladamente en la revista Biotechnic&Histochemistry.
Tinción directa: cuando el colorante interacciona directamente con el sustrato, sin otro tratamiento previo.
Tinción indirecta: las tinciones que hacen uso de un mordiente, un mordiente habitual es el ácido tánico.
Tinción negativa: un método sencillo para bacterias, aplicando directamente sobre la muestra en el portaobjetivos una gota de nigrosina o tinta china y cubriendo luego la muestra humedecida con un cubreobjetivos.
Colorantes histológicos más comunes
La mayoría de los colorantes son compuestos orgánicos que tiene alguna afinidad específica por los materiales celulares:
Cationes: se combinan con intensidad con los constituyentes celulares cargados negativamente (ácidos nucléicos y polisacáridos ácidos), como azul de metileno, el cristal violeta y la safranina.
Aniones: se combinan con intensidad con los constituyentes celulares cargados positivamente (proteínas), como eosina, la fucsina ácida y el rojo Congo.
Sustancias liposolubles: se combinan con los materiales lipídicos de la célula (gotícolas o depósitos de grasa), como negro Sudán.
Un procedimiento simple de tinción es el “azul de metileno”, es un buen colorante que actúa sobre todas las células bacterianas rápidamente y que no produce un color tan intenso que oscurezca los detalles celulares.

Colorantes en microscopía óptica:
azul brillante de Coomassie: tiñe todas las proteínas con un fuerte color azul
azul de metileno: hace visibles núcleos de células animales, extendidos de sangre
azul de Nilo: tiñe los núcleos de color azul
Bismarck bown: tiñe de color amarillo las mucinas ácidas
Bromuro de etidio: se intercala en el ADN, tiñe con rojo naranja fluorescente
Carmín: tiñe de color rojo el glicógeno
Cristal violeta: tiñe las paredes celulares de color púrpura
DAPI: tiñe el núcleo, fosforescente
Eosina: tiñe rosado membrana y material del citoplasma
Fucsina ácida: para teñir colágeno, músculo liso o mitocondrias
Hematoxilina: tiñe el núcleo, de color azul violeta o negro, se suele usar con eosina
Hoechst: se une al ADN, emite luz azul cuando recibe luz ultravioleta
Lugo: tiñe el almidón, es yodo da color negro cuando hay almidón sobre todo plantas
Naranja de acridina: colorante fluorescente para ácidos nucleídos ADN y el ARN
Plata: tiñe proteínas y ADN
Rodamina: tinción fluorescente para proteínas
Rojo neutro: colorea de rojo a la substancia de Nissl
Rojo de Nilo: oxazona del azul Nilo, colorea de rojo glóbulos lipídicos
Safranina: tiñe el núcleo, también colorea el colágeno de amarillo
Sudan: destaca sustancias “sudanófilas (lipídicas)” como grasas fecales
Tetróxido de osmio: tiñe lípidos, color marrón o negro
Verde de metilo: tiñe cromatina de las células
Verde malaquita: “coloración de Giménez” en bacterias, también colorea endosporas

Colorantes en microscopía electrónica:
Ácido fosfotúnstico: tiñe virus, nervios y polisacáridos
Tetróxido de osmio: tiñe lípidos
Tetróxido de rutenio: colorea materiales resistentes al anterior como polietileno

 

Bibliografía:
Kiernan, J. A., “Histological and Histochemical Methods, theroy and practice”, Bloxham, UK”, 2008
Penney, D. P.; Powers, J.M.; Frank, M.; Churukian, C.; “Analysis and testing of Biological Stains- Biological Stain Commission Proceedures” Biotechnic &Histochemistry, 2002
Horobin, R.W.; Kiernan, J.A; “Conn´s Biological Stains. Hanbook of Dyes Stains and Fluorochromes for Use in Biology and Medicine”. Oxford: BIOS, 2002
Andoni J. Duarte; “Historia de la Histología”, Rev. Med. Hondur, 2015

 

Links relacionados:

Atlas de Histología Vegetal y Animal. Universidad de Vigo
https://mmegias.webs.uvigo.es/

Atlas de Histología. Univ. Autónoma de México. UNAM
http://www.facmed.unam.mx/deptos/biocetis/atlas2013A/

Técnicas histológicas. SPTI-IOC/ Fiocruz
https://www.youtube.com/watch?v=HjXNWhewgdU

 

 

 

 

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