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Western Blot, inmunoblot o electrotransferencia, es una técnica de laboratorio usada en biología celular o molecular para estudiar proteínas, desarrollada en la Universidad de Stanford en 1975 por un biólogo molecular británico Edwin Southern.
Los principales componentes de cualquier tipo celular son las proteínas, los lípidos, los hidratos de carbono, el ADN y el ARN. Las proteínas desempeñan muchas funciones en el organismo: estructural, metabólica, transducción de señal, defensa, movimiento, transporte, comunicación, reconocimiento y almacenamiento.
Debido a las múltiples funciones de las proteínas una alteración ocasiona una enfermedad, así el Western blot es una de las técnicas más usadas en el estudio de la biología molecular cuando queremos medir si una proteína específica se expresa en la muestra de un tejido entero o de un cultivo celular.
Imprescindible en biología molecular, la bioquímica, la biotecnología o la inmunología, se usa para detectar enfermedades.
En palabras de Lawrence C. Brody, Ph.D. (Senior Investigator, National Human Genome Research Institute NIH USA.gov) “podemos preguntarnos si la proteína de interés se expresa en la muestra y tener una idea de la concentración, asi como la composición y el tamaño de la proteína”, Dr. Lawrence Brody estudia los componentes hereditarios de las enfermedades humanas, interesado en las mutaciones genéticas que guían perturbaciones en las vías metabólicas y causan desordenes tales como cancer o defectos de nacimiento.
El método implica:
- Electroforesis en gel: para separar las proteínas de la muestra
- Transferencia de las proteínas separadas del gel a la superficie de una membrana (generalmente de nitrocelulosa o de PVDF).
- Exposición de la membrana a un anticuerpo específico contra la proteína que queremos estudiar
Se detecta con un marcador radiactivo o químico.
Las muestras se toman de un cultivo celular o de un tejido. Las células se lisan mediante uno de estos dos métodos:
- Mecánico: el tejido se introduce en un buffer de extracción, luego se homogeneiza en una licuadora y luego se centrifuga para obtener las proteínas en el sobrenadante.
- Detergentes: sales o tampones. Añadiendo inhibidores de proteasas y fosfatasas para evitar la digestión de las proteínas.
Para detectar dónde está la proteína se pueden usar enzimas que catalizan la transformación de un sustrato soluble en un “producto insoluble”, así vemos donde está la proteína al aparecer una mancha, usando peroxidasa de rábano (HRP) o una fosfatasa alcalina.
Otro método es usar un enzima que cataliza una reacción quimioluminiscente, así la peroxidasa cataliza la oxidación de luminol en presencia de peróxido de hidrógeno, generándose luz.
Esta técnica “Western blot” sirve para diagnosticar enfermedades infecciosas, como anticuerpos anti-VIH en una muestra de suero humano, en encefalopatía espongiforme bovina, en la enfermedad de Lyme. En veterinaria para confirmar la presencia del FIV en gatos.
Bibliografía:
Lawrence C. Brody, Ph.D.
https://irp.nih.gov/pi/lawrence-brody
https://www.genome.gov/staff/Lawrence-Brody-PhD
Ma, Hongbao; “Western Blotting Method”, The Journal of American Science (Department of Medicine, Michigan State University, EE. UU) 2(2): 23-27. 2006
https://studylib.net/doc/7656960/western-blotting-method—the-journal-of-american-science
Mahmood, Tahrin; Yang, Ping-Chang; “Technique, Theory and Trouble Shooting”, North American Journal of Medical Sciences. Sep 4(9):429-434. 2012
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3456489/
Towbin, H.; Stachelin, T; Gordon, J. “Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some appli-cations”. Proc Natl Acad Sci U S A. 76(9):4350-4. 1979
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/388439/
Análisis de proteínas Ecogen- Advansta
